摘要:體外核酸快速擴增技術是一種可使微量核酸在體外高效快速擴增的技術。重組酶介導的擴增(recombinase-aid amplification,RAA)技術是在現有體外核酸擴增原理的基礎上發展起來的恒溫體外快速擴增核酸技術。RAA 法利用重組酶、單鏈結合蛋白和DNA 聚合酶代替了傳統PCR 的熱循環解鏈過程, 實現了在37℃恒溫下的核酸快速擴增,有望在不遠的將來取代傳統的熱循環PCR 反應。

Abstract: Nucleic acid amplification is a biotechnology that trace nucleic acid can be rapidly amplified in vitro. Recombinase-aid amplification (RAA) is the  most recent isothermal amplification technology, in which the classical thermal  stable enzyme has been replaced by recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and DNA polymerase. Therefore, the RAA reaction can be carried out at optimized37°C or under the room temperatures without any heating assistance. These merits could largely facilitate RAA more applicable than PCR in the near future.

關鍵詞:重組酶  體外核酸擴增

 

在過去10年中,若干恒溫核酸擴增技術得到快速發展[1],如SDA技術、TMA技術、HDA技術、LAMP技術和RPA/RAA技術等。本文介紹的 重組酶介導擴增 (recombinase-aid amplification,RAA)技術是一種在恒溫下可以使核酸快速擴增的方法。 與RPA 不同的是, RAA 擴增法使用的是從細菌或真菌中獲得的重組酶[2]。在37℃恒溫下, 該重組酶可與引物DNA 緊密結合, 形成酶和引物的聚合體,當引物在模板DNA 上搜索到與之完全互補的序列時,在單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNA binding, SSB)的幫助下,使模板DNA 解鏈,并在DNA 聚合酶的作用下,形成新的DNA 互補鏈。反應產物也是以指數級增長,通常在1 h 內即能得到可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增片段[3],整個反應簡單快速,因為不需要高溫循環,所以特別適合在有大量樣品的非實驗室檢測場所使用。

 

1. 材料與方法

1.1 蛋白與DNA 

天藍色鏈霉菌重組酶蛋白(SC-recA)和枯草芽孢桿菌重組酶蛋(BS-recA)分別來自天藍色鏈霉菌和枯草芽孢桿菌.將天藍色鏈霉菌、枯草芽孢桿菌重組酶基因分別克隆至pET21a表達載體中,過量表達后用Ni-NTA 親和層析純化,并用Bradfo-rd 法定量。重組DNA 是rnd 基因編碼區的一部分(310 bp),將此片段連接到載體上, 轉化大腸桿菌獲得含重組DNA 的菌株(Top10)。


1.2 RAA 擴增

將含有目的片段的大腸桿菌Top10 菌株過夜培養,從中取出1 mL 菌液,100℃加熱10 min。冷卻至室溫,從中取出1 μL 作為擴增模板。引物A、B 大小分別為34 和32 nt。反應體系如下:50 pmol 引物A;50pmol 引物B; 1 mmol/L dNTP; 90 ng/μL SSB 蛋白; 120ng/μL recA 重組酶蛋白(SC-recA/BS-recA);30 ng/μL Bsu DNA 聚合酶;反應緩沖液(100 mmol/L Tricine,pH 8.0;100 mmol/L 醋酸鎂;5mmol/L 二硫蘇糖醇; 5%PEG 20K;2.5 mmol/L ATP;100 ng/μL 肌酸激酶)。搖勻后放置于37℃培養箱溫浴1 h。 取10 μL 反應產物經酚/氯仿提純后, 在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

 

2. 結果與分析

在細菌或真菌DNA 復制過程中,重組酶蛋白起著重要的作用。重組酶蛋白可與單鏈DNA 結合而阻止細胞核內核酸酶對單鏈DNA的降解,在DNA重組過程中, 重組酶還負責基本的堿基配對[4]。當然,在體內,還會有其他輔助性蛋白,如recB,recC 和單鏈DNA 結合蛋白等,共同參與到DNA 的重組中。因此,在進行核酸體外擴增時,重組酶蛋白無疑是起著決定性作用的反應催化劑。為了驗證重組酶的作用,設計了有針對性的RAA 擴增體系,除了SC-recA、BSrecA重組酶外,還加入了DNA 聚合酶和輔助蛋白Bsu 等。

實驗結果表明,在目前的反應體系中,含有SC-recA 和BS-recA 重組酶的反應體系都可以正確擴增出目的片段,說明SC-recA 和BS-recA 重組酶均具有催化功能,而且反應的特異性很高。擴增的目的片段長310 bp,是之前克隆到載體里的rnd 基因編碼區的一部分。

 

3. 結論

3.1 重組酶蛋白在RAA 反應中的作用

重組酶都能夠與DNA 緊密結合,這是使核酸體外擴增反應順利進行的關鍵一步。在體外核酸擴增體系中,重組酶蛋白的作用是幫助DNA 模板的解鏈和促使模板與引物之間發生鏈替換,隨后在DNA 聚合酶的催化下,擴增出新的DNA 片段[5]。這一替換過程需要ATP 來提供能量,然后在單鏈結合蛋白的輔助下,Bsu DNA 聚合酶可以對鏈替換后的目的DNA 進行特異地延伸。由于ATP 在CK激酶催化下可以利用磷酸肌酸(phosphocreatine)實現再生,使這一反應過程中的化學平衡傾向于產物的合成,并且這一過程可以被不斷地重復,從而最終實現核酸的高效擴增。


3.2 重組酶介導擴增法反應的建立和優化。

在RAA 反應中,酶無疑是最重要的成分,酶的純度直接決定了反應能否順利進行,因為反應僅在37℃下進行,任何不必要的雜質都會影響到反應的結果,特別是核酸酶的污染,而核酸酶在傳統的高溫PCR 中幾乎可以被忽略。因此,在進行酶的純化時,特別強調核酸酶的去除,以及保持酶的活性。通過Ni-NTA 親和層析(Ni-NTA agarose)可以去掉大部分雜質,獲得高純度的酶.每個反應中酶的定量也很重要,除了重組酶,還有3~4 個酶參與擴增反應,它們之間需要合理的比例,才能夠得到預期的擴增結果。  

RAA常溫核酸擴增法對模板是不挑剔的,可以是質粒DNA,也可以是含有質粒的菌液,動植物DNA均可以作為模板。甚至可以使用RNA 直接作為模板,而無需額外的逆轉錄過程。RAA法擴增對核酸中的GC含量也不受限制,所以能有效解決許多疑難PCR的問題并且非常適合用于全基因組擴增。

RAA方法中引物與模板嚴格互補的特點,使其可以用于SNP 和甲基化的檢測,只要與引物配對的模板DNA上有一個堿基的差異,就可以用RAA 方法檢測出來。


3.3 RAA 常溫擴增的應用前景

RAA技術的優勢使其有望在很大程度上代替傳統的PCR技術。由于傳統的PCR技術受儀器和空間的限制,使得現有核酸擴增技術的應用價值沒有被充分挖掘出來。RAA技術不依賴于PCR儀器的便捷性能,是革命性的技術突破,能充分擴大核酸擴增技術的應用領域。此外,RAA技術還能完成多重引物擴增,配合熒光儀,可形成一套RAA多重熒光實時檢測系統,即利用不同顏色的熒光標記,在同一個反應里檢測到不同的目的基因,這是其他恒溫核酸擴增技術或巢式PCR技術無法相比的特點。

隨著RAA技術的進一步深化、完善,在RAA技術的基礎上可以很快地研發出適合家庭使用的分子診斷試劑,使全國乃至全球對病毒性和遺傳性疾病的定期和快速普查在技術上成為可能。這將是一個非常巨大的潛在市場,其經濟意義不可估量。結合其他優秀技術,如發展免疫RAA,可使檢測對象從核酸擴大到蛋白質、糖類或其他大分子化合物。同時,RAA技術也可作為一種基礎的研究手段,進一步促進分子生物學的研究。RAA技術極有可能幫助功能基因組學和植物分子生物學獲得突破性進展,進而形成更加巨大的生物科技產業。

 

 

【參考文獻】

[1] Gill p, Ghaemi A, Nucleic acid isothermal amplification technologies: a review. Nulcleosides, nucleotides& nucleic acids, 2008, 27:224-243

[2] 彭濤. 核酸等溫擴增技術及其應用. 北京: 科學出版社, 2009. 98

[3] 呂蓓,程海榮,嚴慶豐,等.用重組酶介導擴增技術快速擴增核酸.中國科學:生命科學,2010,40(10):983-988.

[4] Kuzminov A. DNA replication meets genetic exchange: cromosomal damage and its repair by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 8461—8468

[5] 呂蓓,張志芳等  體外核酸快速擴增技術的發展和不斷創新。中國生物工程雜志, 2011,31(3):91-96 

2017年09月11日

精彩回顧︱RAA技術亮相食品微生物檢測與控制技術交流會
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